安装指南

# 激活choppy环境
source activate choppy
# 安装app
choppy install chenziyin/miRNAseq

快速使用

1. 新建项目文件夹

2. 准备样本描述文件：samples.csv

   • 文件需为csv格式（以逗号分隔的文本）
   • 文件中必须包含的列为：
     • sample_id：样本名称，该名称将自动作为生成结果文件的前缀名
     • raw_fastq：原始FASTQ测试数据所在OSS路径
     • adapter_seq：建库时所使用3’ 接头序列（详见附录A. 常用建库方法接头序列）
     • randomBase_in_adapter：接头末端的随机碱基个数（详见附录A. 常用建库方法接头序列）

注意：

使用excel制作csv文件时，请不要将保存的csv文件直接作为输入，易导致异常错误。

推荐使用文本编辑器（如记事本，notepad++等）打开csv文件，确认：

（1）每2个值之间使用逗号分隔，行末没有逗号

（2）逗号前后没有多余的空格（非常重要！！！）

（3）每行前后没有多余的逗号，且没有多余的仅由逗号组成的行

如果在服务器上运行choppy，推荐使用 vim samples.csv 命令新建samples.csv文件，并将表格以逗号分隔的纯文本形式粘贴至其中，并按esc+ZZ 退出

1. 批量提交任务

   choppy batch miRNAseq-latest <File::samples.csv> --project-name <String::project_name>

参数说明：

• <File::samples.csv>：此处填写在上一步之做的samples.csv所在路径
• <String::project_name>：自定义项目名称，app的运行结果将自动存储在以该名称命名的文件夹下

注意：

1） 左右尖角括号（<>）代表此处的值需要由用户根据实际情况键入相应的值。替换入具体值后左右不需要保留尖叫括号

2）--project-name为必须参数，是用户自定义的项目名称。可以任意命名，但需遵从一下原则：

  a. project_name中不得包含空格，短横线，否则会导致运行异常
  b. project_name中可以包含阿拉伯数字，但不得以数字开头，否则会导致运行异常

app测试

用于app测试的文件位于 oss://choppy-app-example-data/miRNAseq/ 目录下

• Test_10k_NEXTflex.fastq.gz 中包含了NEXTflex small RNA kit v3所建文库的测序结果中的前10000条read

• test_10k_QIAseq.fastq.gz 中包含了QIAseq miRNA kit所建文库的测序结果中的前10000条read

• samples.csv是app测试时所需提交的samples.csv文件

输出文件说明

运行APP后，

每个sample对应一个文件夹，文件夹下结构如下：

— call-Align2Mature

​ — .align2mature.log

​ — .align2mature.sam

​ — .matureUnaligned.fastq

— call-LengthStats

​ — .trimAdapt.lengthDistribute

— call-ReadFilter

​ — .trimAdapt.filter.fastq.gz

​ — .filter.log

— call-ReadStats

​ —.readStats

— Call-TrimAdapt/

​ — .trimAdapt.fastq.gz

​ — .trimAdapt.log

• .matureMiR.readCount：定位到每个miRNA的原始read数

• 质量控制文件

  • .readStats：文库中read去向
  • Total Input：测序得到的总read数
  • Adapter dimer：引物二聚体read数
  • Low quality：由于质量不符合要求损失的read数（包括单碱基质量过低，或N碱基数目过多）
  • Too short：由于插入片段长度过短损失的read数
  • For align： 所有通过质量过滤，进入序列比对环节的的片段数

  • Mature miRNA：成熟miRNA片段数

  • .trimAdapt.lengthDistribute：文库中插入片段长度分布

APP概述

miRNAseq analysis pipeline 是一个全自动app，用于对miRNA-seq二代测序FASTQ结果中的human miRNA片段定量。

适用范围：

1. 本APP适用于ILLUMINA系列测序仪（HiSeq, NextSeq, NovaSeq等）产生的SE50/SE75二代测序数据。对于PE数据，请提供R1 FASTQ和3‘接头序列作为数据源

2. 本APP默认用于Human miRNA定量。如用于其他物种，请通过 dir_index_mature和prefix_index_mature参数制定相应物种的参考miRNA序列组

3. 目前尚不支持UMI分析

流程与参数

适用的软件及版本

• Fastp：0.19.6
• Bowtie: 1.2.2

流程示意

参考基因组

下载自 miRBase v22.1 ( http://www.mirbase.org ）mature.fa 并进行一下编辑：

（1）仅提取出其中人miRNA序列

（2）将U碱基转化为T碱基

（3）合并序列相同的 miRNA ID

（4）根据成熟体所对应的剪切前体（pre-miRNA），将成熟体序列两端各延伸5bp

详细参数

1. 切除接头：根据adapter_sequence 序列进行切除，切除时使用fastp默认参数

2. 质量过滤：

1）一条read中，质量不满足qualified_quality_phred（default:20） 的碱基在read占比超过unqualified_percent_limit(default:20)%时，该read将被过滤

2） read中，N碱基数目超过n_base_limit (default: 5)的read将被过滤

1. 长度过滤：去接头后长度小于length_required（default：16）的read将被过滤

2. miRNA识别

   • 使用bowtie（end-to-end模式）进行匹配

   • 配对后，错配碱基的质量和小于sum_unmatch_quality_limit (default:40)即被认定匹配成功

     • 即错配碱基测序置信度较高（Q-value>30）时，最多允许1个错配。
     • 随着错配碱基测序置信度（Q-value）的降低，允许的错配数增多

附录

A.常用建库方法及接头序列

建库试剂盒	adapter_seq	randomBase_in_adapter	参考资料
Truseq smallRNA library prep kit (Illumina)	TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG	0	[1]
QIAseq miRNA Library Kit (QIAGEN)	AACTGTAGGCACCATCAAT	0	[2
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB)	AAGATCGGAAGAGCACACGTCT	0	[3]
NEXTflex small RNA Kit	TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG	4	[4]

[1] Illumina Adapter Sequences (1000000002 v07) From http://support.illumina.com.cn/downloads/illumina-customer-sequence-letter.html

[2] https://www.qiagen.com/us/resources/faq?id=f12b85b4-df4f-43b5-9e82-a4fd0ddbdc&lang=en

[3] NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina manual

[4] NEXTflex® Small RNA-Seq Kit v3 Automation Guide

B. FAQ

**Q1 结果中没有检测到miRNA / miRNA检出率过低 **

A2.

首先需要确认是否切接头成功。方法为打开～/Call-TrimAdapt/trimAdapt.log日志文件，查看Filtering result*项目下的：

reads with adpater trimmed：该项为接头切除成功的read数，数值过低说明接头识别失败，需要检查提供的接头序列（adapter_seq）是否正确。

之后打开～/call-ReadStats/.readStats文件查看文库中片段组成：

（1）Adapter dimer较高提示建库过程中连接效率低，文库产物被大量的引物二聚体所占据

（2）Low quality较高提示此次测序质量较差，可以用于比对的片段占比较低

（3）Too short：较高提示抽提/建库过程存在问题或者样本质量较差，导致文库中插入大量的短（16bp一下）片段

（4）若For align： 项数值正常，而检测到的miRNA数量低，考虑

​ a. 如果建库时使用了4N引物，

​ 查看samples.csv中，randomBase_in_adapter是否设置正确。

​ 查看～/call-TrimAdapt/.trimAdapt.log日志文件，若其中没有trim 4 random base相关记录，则可能是randomBase_in_adapter设置不正确

​ 打开～ /call-LengthStats/.trimAdapt.lengthDistribute，若片段主要分布在32bp附近，则很可能是4N碱基未切除成功

​ b. 如果建库时未使用4N引物

​ 打开～ /call-LengthStats/.trimAdapt.lengthDistribute，查看片段长度分布