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miRNAseq
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用于miRNA-seq二代测序数据分析
You can not select more than 25 topics Topics must start with a letter or number, can include dashes ('-') and can be up to 35 characters long.
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chenziyin fd7ee12059 调整匹配优先级 5 years ago
assets Initial version 6 years ago
tasks 修正错误 6 years ago
README.md 修正格式错误 6 years ago
ReadStats.wdl 错误修正 6 years ago
inputs 同步至HPC-v20190527版 6 years ago
workflow.wdl 调整匹配优先级 5 years ago

README.md

安装指南

# 激活choppy环境
source activate choppy
# 安装app
choppy install chenziyin/miRNAseq

快速使用

  1. 新建项目文件夹

  2. 准备样本描述文件：samples.csv

    • 文件需为csv格式（以逗号分隔的文本）
    • 文件中必须包含的列为：
      • sample_id：样本名称，该名称将自动作为生成结果文件的前缀名
      • raw_fastq：原始FASTQ测试数据所在OSS路径（仅R1）
      • adapter_seq：建库时所使用3’ 接头序列（详见附录A. 常用建库方法接头序列）
      • randomBase_in_adapter：接头末端的随机碱基个数（详见附录A. 常用建库方法接头序列）
      • sequencing_length: 测序长度，如使用PE150测序时填写150

注意：

使用excel制作csv文件时，请不要将保存的csv文件直接作为输入，易导致异常错误。

推荐使用文本编辑器（如记事本，notepad++等）打开csv文件，确认：

（1）每2个值之间使用逗号分隔，行末没有逗号

（2）逗号前后没有多余的空格（非常重要！！！）

（3）每行前后没有多余的逗号，且没有多余的仅由逗号组成的行

如果在服务器上运行choppy，推荐使用 vim samples.csv 命令新建samples.csv文件，并将表格以逗号分隔的纯文本形式粘贴至其中，并按esc+ZZ 退出

  1. 批量提交任务
   choppy batch miRNAseq-latest <File::samples.csv> --project-name <String::project_name>

参数说明：

  • <File::samples.csv>：此处填写在上一步之做的samples.csv所在路径
  • <String::project_name>：自定义项目名称，app的运行结果将自动存储在以该名称命名的文件夹下

注意：

1） 左右尖角括号（<>）代表此处的值需要由用户根据实际情况键入相应的值。替换入具体值后左右不需要保留尖叫括号

2）--project-name为必须参数，是用户自定义的项目名称。但需注意：

  a. project_name中不得包含空格，短横线，否则会导致运行异常
  b. project_name中可以包含阿拉伯数字，但不得以数字开头，否则会导致运行异常
  c. 项目名称不得与已有的项目名称（包含 oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/ 目录下的文件夹名称和test-choppy服务器目录下的文件夹名称）相同
  d. 推荐的[项目命名格式]<http://choppy.3steps.cn/go-choppy/choppy-docs/issues/1>为：Project_computecontent_data_people，如:```ANY180412MAQC_rnaseq_190609_lizhihui```

app测试

用于app测试的文件位于 oss://choppy-app-example-data/miRNAseq/ 目录下

  • Test_10k_NEXTflex.fastq.gz 中包含了NEXTflex small RNA kit v3所建文库的测序结果中的前10000条read

  • test_10k_QIAseq.fastq.gz 中包含了QIAseq miRNA kit所建文库的测序结果中的前10000条read

  • samples.csv是app测试时所需提交的samples.csv文件

输出文件说明

运行APP后，

每个sample对应一个文件夹，内部结构如下：

  • call-Fastqc
    • fastqc.html
    • fastqc.zip
  • call-TrimAdapt
    • .trimAdapt.fastq.gz
    • .trimAdapt.log
    • .trimAdapt.lengthDistribute
  • call-ReadFilter
    • .trimAdapt.filter.fastq.gz
    • .filter.log
  • call-Align2miRNA
    • .align2miRNA.log
    • .align2miRNA.sam
    • .miRNAUnaligned.fastq.gz
  • call-Align2PreMiRNA
    • .align2PreMiRNA.log
    • .align2PreMiRNA.sam
    • .PreMiRNAUnaligned.fastq.gz
  • call-Align2piRNA
    • .align2piRNA.log
    • .align2piRNA.sam
    • .piRNAUnaligned.fastq.gz
  • call-Align2tRNA
    • .align2tRNA.log
    • .align2tRNA.sam
    • .tRNAUnaligned.fastq.gz
  • call-Align2RNA
    • .align2RNA.log
    • .align2RNA.sam
    • .RNAUnaligned.fastq.gz
  • call-Align2Hg38
    • .align2Hg38.log
    • .align2Hg38.sam
    • .Hg38Unaligned.fastq.gz
  • call-Quantification
    • .matureMiR.readCount
  • call-ReadStats
    • .readStats
    • .trimAdapt.filter.align2RNA.grouped.readCount

主要结果说明

定量结果
  1. miRNA定量表达谱： /call-Quantification/<sample_ID>.matureMiR.readCount
    • 包含两列：
      • ID.miRNA
      • ReadCount：定位到相应miRNA的read数（即Raw Count）
质控结果

  1. 测序质量检测：call-Fastqc/*._fasqtc.html

    • 网页格式，下载后使用浏览器打开
    • 重点关注以下内容：
      • 单碱基测序质量（Per base sequence quality）：横轴长度在75bp前的部分，单碱基质量值应不低于28（绿色部分）
      • N碱基个数（Per base N count）：红线应紧贴X轴
      • 测序片段长度（Sequence Length Distribution）：曲线呈单峰分布（三角形），且峰值与预期测序长度相一致

  2. 片段类型统计：/call-ReadStats/<sample_id>.readStats

    • 可能的片段类型包括：
      • adapter not found：因无法识别接头而被丢弃的片段数 > 原因：片段3’接头部分存在插入缺失突变（多数），片段中无3’接头序列（少数）
      • adapter dimer：引物二聚体片段数
      • too short：因插入片段长度过短而被丢弃的片段数
      • low sequencing quality： 由于质量不满足要求丢弃的read数（包括单碱基质量过低，或N碱基数目过多）
      • mature miRNA：比对到miRNA成熟体参考序列的片段数
      • hairpin miRNA: 比对到miRNA剪切前体参考序列（pre-miRNA）的片段数
      • piRNA： 比对到piRNA参考序列的片段数
      • tRNA： 比对到tRNA参考序列的片段数
      • mRNA： 比对到mRNA参考序列的片段数
      • lncRNA： 比对到lncRNA参考序列的片段数
      • rRNA： 比对到rRNA参考序列的片段数
      • YRNA： 比对到YRNA参考序列的片段数
      • other small RNA： 比对到 misc_RNA, guide_RNA, vault_RNA, small nuclear RNA, small cytoplasmic RNA 或 small nucleolar RNA 参考序列的片段数
      • other from transcriptome: 比对到人转录组，但比对结果不属于以上mature miRNA等9个类别的片段数
      • other from human genome: 能比对到人类参考基因组，但不能比对到转录组上的片段数
      • not from human genome：不能比对到人类曹考基因组的片段数

  3. 文库中插入片段长度分布： call-TrimAdapt/trimAdapt.lengthDistribute

    • 包含两列，记录不同长度（第一列）的插入片段数目（第二列）


APP概述

miRNAseq analysis pipeline 是一个全自动app，用于对miRNA-seq二代测序FASTQ结果中的human miRNA片段定量。

适用范围：

  1. 本APP适用于ILLUMINA系列测序仪（HiSeq, NextSeq, NovaSeq等）产生的SE50/SE75二代测序数据。对于PE数据，仅使用R1作为数据源

  2. 本APP仅用于Human miRNA-seq文库数据分析。

  3. 目前尚不支持UMI分析

流程与参数

使用的软件及版本

  • fastqc: 0.11.5
  • fastp：0.19.6
  • bowtie: 1.2.2

流程示意

参考基因组

mature miRNA

下载自 miRBase v22.1 ( http://www.mirbase.org ）mature.fa 并进行以下编辑：

（1）仅提取出其中人miRNA序列

（2）将U碱基转化为T碱基

（3）根据成熟体所对应的剪切前体（pre-miRNA），将成熟体序列两端各延伸5bp

pre-miRNA

下载自 miRBase v22.1 ( http://www.mirbase.org ）hairpin.fa 并进行以下编辑

（1）仅提取出其中人miRNA序列

（2）将U碱基转化为T碱基

piRNA

下载自 piRBase ([http://www.regulatoryrna.org/database/piRNA/download.html]) Human piRNA sequence v2.0

tRNA

下载自 UCSC Table Browser（[http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables] ）

- Genome: Human, Assembly: Dec.2013(GRCh38/hg38)
- group: all tracks, track: tRNA Genes, table: tRNA
- region: genome, 
- output format: sequence
转录组

全人转录组参考序列下载自 NCBI: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/001/405/GCF_000001405.38_GRCh38.p12/GCF_000001405.38_GRCh38.p12_rna.fna.gz

并根据序列ID中的最后一栏对序列进行分类

全参考基因组

全人参考基因组序列下载自NCBI：[ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/001/405/GCF_000001405.38_GRCh38.p12/ GCF_000001405.38_GRCh38.p12_genomic.fna.gz]

详细参数

  1. 切除接头：根据adapter_sequence 序列进行切除，切除时使用fastp默认参数

  2. 质量过滤：

1）一条read中，质量不满足qualified_quality_phred（default:20） 的碱基在read占比超过unqualified_percent_limit(default:20)%时，该read将被过滤

2） read中，N碱基数目超过n_base_limit (default: 2)的read将被过滤

  1. 长度过滤：去接头后长度小于length_required（default：16）的read将被过滤

  2. miRNA识别

    • 使用bowtie（end-to-end模式）进行匹配

    • 匹配时最多允许max_mismatch_allowed (default: 1)个错配

附录

A.常用建库方法及接头序列

建库试剂盒 adapter_seq randomBase_in_adapter 参考资料
Truseq smallRNA library prep kit (Illumina) TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG 0 [1]
QIAseq miRNA Library Kit (QIAGEN) AACTGTAGGCACCATCAAT 0 [2
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB) AAGATCGGAAGAGCACACGTCT 0 [3]
NEXTflex small RNA Kit TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG 4 [4]

[1] Illumina Adapter Sequences (1000000002 v07) From http://support.illumina.com.cn/downloads/illumina-customer-sequence-letter.html

[2] https://www.qiagen.com/us/resources/faq?id=f12b85b4-df4f-43b5-9e82-a4fd0ddbdc&lang=en

[3] NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina manual

[4] NEXTflex® Small RNA-Seq Kit v3 Automation Guide

B. FAQ

**Q1 结果中没有检测到miRNA / miRNA检出率过低 **

A1.

首先需要确认是否切接头成功。

  1. 打开～/Call-TrimAdapt/trimAdapt.log日志文件
  2. 查看Filtering result*项目下的reads with adpater trimmed：
    • 该项为接头切除成功的read数
    • 数值过低说明接头识别失败，需要检查提供的接头序列（adapter_seq）是否正确。
  3. 查看Filtering result*项目下的reads failed due to too long
    • 如果reads with adapter trimmed与reads failed due to too long两项之和不等于总read数，检查samples.csv文件中提供的sequencing_length是否填写正确
  4. 如果建库中使用4N接头，查看日志文件中是否进行了随机碱基切除（Trim 4 random base from both sides）
    • 如果app没有进行该步骤，检查samples.csv中的randomBase_in_adapter一列是否填写正确

之后打开～/call-ReadStats/.readStats文件查看文库中片段组成：

（1）adapter dimer（>20%)较高提示建库过程中连接效率低，文库产物被大量的引物二聚体所占据

（2）low quality较高(>10%)提示此次测序质量较差，可以用于比对的片段占比较低，可以结合fastqc.html结果查看原因

（3）too short：较高提示文库中存在大量短（16bp一下）片段，可能是抽提/建库过程存在问题或者样本质量较差，具体可结合 .trimAdapt.lengthDistribute 查看序列分布情况

（4）Not from human genome较高（>30%）时，建议手动查看原始序列，并将序列去接头后使用NCBI Blast判断可能的片段来源