中华家系1号标准物质室间质评报告系统分析流程

Author： Run Luyao

E-mail：18110700050@fudan.edu.cn

Git: http://choppy.3steps.cn/renluyao/Quality_control.git

Last Updates: 30/8/2019

安装指南

# 激活choppy环境
source activate choppy
# 安装app
choppy install renluyao/Quality_control

App概述——中华家系1号标准物质介绍

建立高通量全基因组测序的生物计量和质量控制关键技术体系，是保障测序数据跨技术平台、跨实验室可比较、相关研究结果可重复、数据可共享的重要关键共性技术。建立国家基因组标准物质和基准数据集，突破基因组学的生物计量技术，是将测序技术转化成临床应用的重要环节与必经之路，目前国际上尚属空白。中国计量科学研究院与复旦大学、复旦大学泰州健康科学研究院共同研制了人源中华家系1号基因组标准物质（Quartet，一套4个样本，编号分别为LCL5，LCL6，LCL7，LCL8，其中LCL5和LCL6为同卵双胞胎女儿，LCL7为父亲，LCL8为母亲），以及相应的全基因组测序序列基准数据集（“量值”），为衡量基因序列检测准确与否提供一把“标尺”，成为保障基因测序数据可靠性的国家基准。人源中华家系1号基因组标准物质来源于泰州队列同卵双生双胞胎家庭，从遗传结构上体现了我国南北交界的人群结构特征，同时家系的设计也为“量值”的确定提供了遗传学依据。

中华家系1号DNA标准物质的标称值包括高置信单核苷酸变异信息、高置信短插入缺失变异信息和77.9-78.1%的高置信参考基因组区。该系列标准物质可以用于评估基因组测序的性能，包括全基因组测序、全外显子测序、靶向测序，如基因捕获测序；还可用于评估测序过程和数据分析过程中对SNV和InDel检出的真阳性、假阳性、真阴性和假阴性水平，为基因组测序技术平台、实验室、相关产品的质量控制与性能验证提供标准物质和标准数据。

该Quality_control APP用于全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）数据的质量评估，包括原始数据质控、比对数据质控和突变检出数据质控。

流程与参数

1. 原始数据质量控制

Fastqc v0.11.5

FastQC是一个常用的测序原始数据的质控软件，主要包括12个模块，具体请参考Fastqc模块详情。

fastqc -t <threads> -o <output_directory> <fastq_file>

Fastq Screen 0.12.0

Fastq Screen是检测测序原始数据中是否引⼊入其他物种，或是接头引物等污染，⽐比如，如果测序样本 是⼈人类，我们期望99%以上的reads匹配到⼈人类基因组，10%左右的reads匹配到与⼈人类基因组同源性 较⾼高的⼩小⿏鼠上。如果有过多的reads匹配到Ecoli或者Yeast，要考虑是否在培养细胞的时候细胞系被污 染，或者建库时⽂文库被污染。

fastq_screen --aligner <aligner> --conf <config_file> --top <number_of_reads> --threads <threads> <fastq_file>

--conf conifg 文件主要输入了多个物种的fasta文件地址，可根据自己自己的需求下载其他物种的fasta文件加入分析

--top一般不需要对整个fastq文件进行检索，取前100000行

2. 比对后数据质量控制

Qualimap 2.0.0

Qualimap是一个比对指控软件，包含Picard的MarkDuplicates的结果和sentieon中metrics的质控结果。

qualimap bamqc -bam <bam_file> -outformat PDF:HTML -nt <threads> -outdir <output_directory> --java-mem-size=32G 

3. 突变检出数据质量控制

Hap.py v0.3.9

hap.py是将被检测vcf结果与benchmarking对比，计算precision和recall的软件，它考虑了vcf中突变表示形式的多样性，进行了归一化。

hap.py <truth_vcf> <query_vcf> -f <bed_file> --threads <threads> -o <output_filename>

Jaccard index (rtg-tools 3.10.1)

Jaccard index是两个集合的交集除以两个集合的并集。这个计算用的是rtg-tools的vcfeval，它将两个vcf中的突变表示格式进行了统一，即两个看似不同的SNV或者INDEL实际上是指同一个突变，这种情况经常发生在重复区域。

rtg vcfeval -b <one_vcf> -c <another_vcf> -o <output_directory> -t <sdf_file>

-t sdf文件是rtg-tools专用的注释文件，由fasta文件转换来

VCF statistics (rtg-tools 3.10.1)

该计算用的是rtg-tools的vcfstats，对vcf中的SNV和INDEL的数目进行了统计。

rtg vcfstats <vcf_file>

4. 质控数据整合

MultiQC v1.8

以上的质控软件的输出都是单个文件的质控结果，multiqc可以将这些结果进行汇总，以及网页可视化展示

multiqc <input_directory>

App输入变量与输入文件

在安装了APP之后，输入一下命令得到需要准备的文件

choppy samples Quality_control-latest --output qcsamples

qcsamples文件

inputJIpiarsFile,inputSamplesFile,sample_id
oss://pgx-result/renluyao/inputJIpiarsFileExample.tsv,oss://pgx-result/renluyao/inputSamplesFileExamples.tsv,1

inputJIpiarsFile是计算Jaccard index的输入文件，按以下格式进行准备

#vcf1	#vcf2	#vcf1_vcf2
oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/wgs_quartettest_renluyao_0827/72f269f2-91b7-4fbe-bde7-99b2e1e3091c/call-Haplotyper/Fudan_DNA_LCL7_hc.vcf	oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/wgs_quartettest_renluyao_0827/7a72d0e6-302d-43ca-b6b0-daeaa0236d06/call-Haplotyper/Fudan_DNA_LCL5_hc.vcf	LCL7_LCL5

vcf1和vcf2是两个需要计算一致性的vcf文件的oss地址

vcf1_vcf2是两个vcf文件名字的简单缩写，用于之后的数据分析

inputSamplesFile是其他质控task的输入文件，按以下格式进行准备

#fastq_read1	#fastq_read2	#bam	#bai	#vcf	#sample_mark
oss://chinese-quartet/quartet-test-data/fastqfiles/Fudan_DNA_LCL5_R1.fastq.gz	oss://chinese-quartet/quartet-test-data/fastqfiles/Fudan_DNA_LCL5_R2.fastq.gz	oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/wgs_quartettest_renluyao_0827/7a72d0e6-302d-43ca-b6b0-daeaa0236d06/call-Dedup/Fudan_DNA_LCL5.sorted.deduped.bam	oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/wgs_quartettest_renluyao_0827/7a72d0e6-302d-43ca-b6b0-daeaa0236d06/call-Dedup/Fudan_DNA_LCL5.sorted.deduped.bam.bai	oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/wgs_quartettest_renluyao_0827/7a72d0e6-302d-43ca-b6b0-daeaa0236d06/call-Haplotyper/Fudan_DNA_LCL5_hc.vcf	LCL5

fastq_read1和fastq_read2是两个fastq文件的oss地址

bam是bam文件的oss地址

bai是bam文件的索引文件的oss地址

vcf是vcf文件的地址

sample_mark是标识测序数据的样本，可填写LCL5、LCL6、LCL7和LCL8

sample_id是choppy app内置的识别标志，写1即可

App输出文件

以下task的输出都只包含了单个文件的质控结果

fastq.wdl

• _fastqc.html
• _fastqc.zip

fastqscreen.wdl

• _screen.png
• _screen.txt
• _screen.html

bamqc.wdl

• _qualimap.zip

benchmark.wdl

• .rtg.vcf.gz
• .rtg.vcf.gz.tbi
• .vcf.gz
• .vcf.gz.tbi
• .roc.all.csv.gz
• .roc.Locations.INDEL.csv.gz
• .roc.Locations.INDEL.PASS.csv.gz
• .roc.Locations.SNP.csv.gz
• .roc.Locations.SNP.PASS.csv.gz
• .summary.csv
• .extended.csv
• .metrics.json.gz

jaccard_index.wdl

• summary.txt

vcfstat.wdl

• onestats.txt

主要查看以下三个task的结果，汇总了所有样本的结果

mergeJI.wdl

• result.txt

mergeNum.wdl

• vcfstats.txt

multiqc

• multiqc_report.html
• multiqc.log
• multiqc_data.json
• multiqc_fastq_screen.txt
• multiqc_fastqc.txt
• multiqc_general_stats.txt
• multiqc_happy_data.json
• multiqc_sources.txt

结果展示与解读

1. result.txt

#vcf1	#vcf2	#vcf1_vcf2	#True-pos-call-number	#False-pos-number	#False-neg-number
oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/wgs_quartettest_renluyao_0827/72f269f2-91b7-4fbe-bde7-99b2e1e3091c/call-Haplotyper/Fudan_DNA_LCL7_hc.vcf	oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/wgs_quartettest_renluyao_0827/7a72d0e6-302d-43ca-b6b0-daeaa0236d06/call-Haplotyper/Fudan_DNA_LCL5_hc.vcf	LCL7_LCL5	4891550	11116	11116

在获得result.txt之后，jaccard index的计算公式如下 JI = TP/(TP+FP+FN)

2. vcfstats.txt

File	Failed Filters	Passed Filters	SNPs	MNPs	Insertions	Deletions	Indels	Same as reference	SNP Transitions/Transversions	Total Het/Hom ratio	SNP Het/Hom ratio	MNP Het/Hom ratio	Insertion Het/Hom ratio	Deletion Het/Hom ratio	Indel Het/Hom ratio	Insertion/Deletion ratio	Indel/SNP+MNP ratio
 /cromwell_inputs/choppy-cromwell-result/test-choppy/qc_test_renluyao_0831/79830609-9bd2-4e0c-9483-0c3369052a9d/call-benchmark/shard-0/Fudan_DNA_LCL5_hc.rtg.vcf.gz	 0	 4904087	 4024591	 0	 421154	 445839	 12503	 0	 1.98 (3771780/1907484)	 1.44 (2897278/2006809)	 1.43 (2371579/1653012)	 - (0/0)	 1.37 (243816/177338)	 1.53 (269380/176459)	 - (12503/0)	 0.94 (421154/445839)	 0.22 (879496/4024591)

3. MultiQC输出的结果

下载之后将文件名glob**改成multiqc_data，即可打开multiqc_report.html查看可视化的结果，在multiqc_data中的整合结果txt文件，可以用于报告系统的输入。

对应的fastqc、fastqscreen、qualimap、hap.py的结果解释请查询对应的官网。

CHANGELOG

Version 1.0 - Auguest 30, 2019

• 完成PGx常规质控流程的choppy APP

FAQ

1. RNAseq和甲基化的质控流程？

可查询multiqc支持的质控模块 https://multiqc.info/docs/#multiqc-modules

RNAseq和甲基化的质控流程待完善

2. 如果样本没有技术重复，该APP中的inputJIpiarsFile是怎么输入的？

在Version 1.0中暂时还没有考虑没有技术重复的问题，可输入姐妹、父母、父女、母女的配对，计算同卵双胞胎、亲属关系和陌生人之间基因突变位点的一致性。

3. 怎么对该APP的输出结果进行可视化？

正在努力开发中

4. bam文件和vcf文件怎么获得？

在进行质控分析前，请先用标准化流程进行测序数据分析，详情查看choppy APP huangyechao/wgs-germline