> Author : Zhihui Li > > E-mail：[18210700119@fudan.edu.cn](mailto:18210700119@fudan.edu.cn) > > Last Updates: 28/02/2020 ## 简介 HISAT+StringTie+Ballgown转录组分析流程主要根据2016年发表在Nature Protocols上的一篇名为Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown的文章撰写的，主要用到以下三个软件：[HISAT] (http://ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml)利用大量FM索引，以覆盖整个基因组，能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对，相较于STAR、Tophat，该软件比对速度快，占用内存少； [StringTie](http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)能够应用流神经网络算法和可选的de novo组装进行转录本组装并预计表达水平。与Cufflinks等程序相比，StringTie实现了更完整、更准确的基因重建，并更好地预测了表达水平；[Ballgown] (https://github.com/alyssafrazee/ballgown)是R语言中基因差异表达分析的工具，能利用RNA-Seq实验的数据(StringTie, RSEM, Cufflinks)的结果预测基因、转录本的差异表达。`rnaseq`是用于 [Choppy-pipe](http://choppy.3steps.cn/) 系统使用的 APP。本APP能生成表达谱所需的Ballgown文件夹。 此版本较[rna-seq之前版本](http://choppy.3steps.cn/lizhihui/rna-seq.git)更新较多，故新建版本。较之前版本主要更新内容如下： 1.添加了生物信息学软件fastp作为数据预处理的工具，fastp可以快速的去掉接头，且速度较快，同时可以进行简单的质控分析 2.hisat软件会输出unmap的序列文件 3.samtools软件会输出ins_size的信息 ## 快速安装及使用 #### Requirements - Python 3 - [choppy](http://choppy.3steps.cn/) - Ali-Cloud 在终端中输入以下命令即可快速安装本APP。 ```bash 1.安装 $ source activate choppy-py3 $ choppy install lizhihui/rnaseq_fastp $ choppy apps 2.使用 $ choppy samples rnaseq_fastp-latest --out Projectname_rnaseq_date_people.csv $ choppy batch rnaseq_fastp-latest Projectname_rnaseq_date_people.csv --project-name Projectname_rnaseq_date_people ``` ## 使用方法 ### 任务的准备 按照上述步骤安装成功之后，可以通过下面简单的命令即可使用APP： ```bash # Generate samples file $ choppy samples rna-seq-latest --out Projectname_rnaseq_date_people.csv ``` `Projectname_fastqc_date_people.csv` 包含以下几个需要填写的参数： - 文件中必须包含的列为： - sample_id：样本名称，该名称将自动作为生成结果文件的前缀名 - read1：原始FASTQ文件所在的OSS路径（仅R1） - read2：原始FASTQ文件所在的OSS路径（仅R2） - adapter_sequence：R1端需要去除的接头，根据实验室常使用的接头，不填则默认为AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA - adapter_sequence_r2：R2端需要去除的接头，根据实验室常使用的接头，不填则默认为AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT ```bash read1,read2,sample_id,adapter_sequence,adapter_sequence_r2 # read1 双端测序数据的R1端在阿里云上的路径信息 # read2 双端测序数据的R2端在阿里云上的路径信息 # sample_id 每个样本任务的识别码。注意：同一个samples文件中，不同样本的ID应该不同 # adapter_sequence R1端需要去除的接头，以"AGATC"的形式填写，可以不填，不填则为默认参数 # adapter_sequence_r2 R2端需要去除的接头，以"AGATC"的形式填写，可以不填，不填则为默认参数 ``` ### 任务提交 在配置好`samples.csv` 文件后，使用以下命令可以提交计算任务： ```bash $ choppy batch rnaseq_fastp-latest Projectname_rnaseq_date_people.csv --project-name Projectname_rnaseq_date_people ``` 提交成功后，即可在工作目录下找到生成的目录名为Projectname_rnaseq_date_people，里面包含了本次提交任务的所有样本信息。 ### 任务输出 任务成功结束后，便可以在阿里云相应的OSS端生成相应的结果文件。包括数据产生的中间结果bam文件以及下游分析所需要的表达谱文件。 ## APP流程概述 ### 流程示意图 ![image-20190828105109404](https://tva1.sinaimg.cn/large/00831rSTgy1gccdjk3sxvj30py0hwwqo.jpg) ​ 我们利用 HiSat2将高质量序列比对到人的参考基因组上，然后利用 Qualimap进行对比对质量评估。最后我们利用StringTie进行转录本重构和定量。使用Ballgown进行基因表达水平质量评估。 ## 输出文件说明 运行APP后， 每个sample对应一个文件夹，内部结构如下： - call-fastp - .html 简单质控报告 - .json - _R1.fastq.gz 去接头后R1端接头后的原始数据 - _R2.fastq.gz 去接头后R2端接头后的原始数据 - call-hisat2 - .sam - _un.fq.1.gz R1端序列文件没有与人类基因组比对上的序列文件 - _un.fq.2.gz R1端序列文件没有与人类基因组比对上的序列文件 - call-samtools - .sorted.bam 用来存储reads到参考序列二进制格式的比对信息，可以用来进行比对质量分析（使用[qualimap APP](http://choppy.3steps.cn/huangyechao/qualimap)分析） - .sorted.bam.bai - .ins_size 分析ins_size的文件便于后续分析 - call-stringtie - .cov.ref.gtf - ballgown 下载后可以用R进行转录组下游分析 - .gene.abundance.txt 下载后可以用R进行转录组下游分析 ## 软件版本及参数 ### 软件版本 1. fastp:0.19.6 2. hisat2 :v2.1 3. samtools:v1.3.1 4. stringtie:v1.3.4 ###使用参数 1. fastp.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc 2. hisat2.cluster: OnDemand bcs.a2.3xlarge img-ubuntu-vpc 3. samtools.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc 4. stringtie.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc 5. gtf:Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf (oss://pgx-reference-data/reference/annotation/Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf) 6. Index:hg38 (oss://pgx-reference-data/reference/hisat2/grch38_snp_tran/) ## 参考文献 [1]Pertea M , Kim D , Pertea G M , et al. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown[J]. Nature Protocols, 2016, 11(9):1650-1667. [2]Shifu Chen, Yanqing Zhou, Yaru Chen, Jia Gu; fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor, Bioinformatics, Volume 34, Issue 17, 1 September 2018, Pages i884–i890, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty560