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| > Author : Zhihui Li | |||
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| > E-mail：[18210700119@fudan.edu.cn](mailto:18210700119@fudan.edu.cn) | |||
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| > Git: <http://choppy.3steps.cn/lizhihui/rna-seq-fastp.git> | |||
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| > Last Updates: 28/08/2019 | |||
| ## 简介 | |||
| HISAT+StringTie+Ballgown转录组分析流程主要根据2016年发表在Nature Protocols上的一篇名为Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown的文章撰写的，主要用到以下三个软件：[HISAT] (http://ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml)利用大量FM索引，以覆盖整个基因组，能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对，相较于STAR、Tophat，该软件比对速度快，占用内存少； | |||
| [StringTie](http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)能够应用流神经网络算法和可选的de novo组装进行转录本组装并预计表达水平。与Cufflinks等程序相比，StringTie实现了更完整、更准确的基因重建，并更好地预测了表达水平；[Ballgown] (https://github.com/alyssafrazee/ballgown)是R语言中基因差异表达分析的工具，能利用RNA-Seq实验的数据(StringTie, RSEM, Cufflinks)的结果预测基因、转录本的差异表达。`rnaseq`是用于 [Choppy-pipe](http://choppy.3steps.cn/) 系统使用的 APP。本APP能生成表达谱所需的Ballgown文件夹。 | |||
| 此版本较[rna-seq之前版本](http://choppy.3steps.cn/lizhihui/rna-seq.git)更新较多，故新建版本。较之前版本主要更新内容如下： | |||
| 1.添加了生物信息学软件fastp作为数据预处理的工具，fastp可以快速的去掉接头，且速度较快，同时可以进行简单的质控分析 | |||
| 2.hisat软件会输出unmap的序列文件 | |||
| 3.samtools软件会输出ins_size的信息 | |||
| ## 快速安装及使用 | |||
| #### Requirements | |||
| - Python 3 | |||
| - [choppy](http://choppy.3steps.cn/) | |||
| - Ali-Cloud | |||
| 在终端中输入以下命令即可快速安装本APP。 | |||
| ```bash | |||
| 1.安装 | |||
| $ source activate choppy-py3 | |||
| $ choppy install lizhihui/rna-seq-fastp | |||
| $ choppy apps | |||
| 2.使用 | |||
| $ choppy samples rna-seq-latest --out Projectname_rnaseq_date_people.csv | |||
| $ choppy batch rna-seq-latest Projectname_rnaseq_date_people.csv --project-name Projectname_rnaseq_date_people | |||
| ``` | |||
| ## 使用方法 | |||
| ### 任务的准备 | |||
| 按照上述步骤安装成功之后，可以通过下面简单的命令即可使用APP： | |||
| ```bash | |||
| # Generate samples file | |||
| $ choppy samples rna-seq-latest --out Projectname_rnaseq_date_people.csv | |||
| ``` | |||
| `Projectname_fastqc_date_people.csv` 包含以下几个需要填写的参数： | |||
| - 文件中必须包含的列为： | |||
| - sample_id：样本名称，该名称将自动作为生成结果文件的前缀名 | |||
| - read1：原始FASTQ文件所在的OSS路径（仅R1） | |||
| - read2：原始FASTQ文件所在的OSS路径（仅R2） | |||
| ```bash | |||
| read1,read2,sample_id | |||
| # read1 双端测序数据的R1端在阿里云上的路径信息 | |||
| # read2 双端测序数据的R2端在阿里云上的路径信息 | |||
| # sample_id 每个样本任务的识别码。注意：同一个samples文件中，不同样本的ID应该不同 | |||
| ``` | |||
| ### 任务提交 | |||
| 在配置好`samples.csv` 文件后，使用以下命令可以提交计算任务： | |||
| ```bash | |||
| $ choppy batch rna-seq-latest Projectname_rnaseq_date_people.csv --project-name Projectname_rnaseq_date_people | |||
| ``` | |||
| 提交成功后，即可在工作目录下找到生成的目录名为Projectname_rnaseq_date_people，里面包含了本次提交任务的所有样本信息。 | |||
| ### 任务输出 | |||
| 任务成功结束后，便可以在阿里云相应的OSS端生成相应的结果文件。包括数据产生的中间结果bam文件以及下游分析所需要的表达谱文件。 | |||
| ## APP流程概述 | |||
| ### 流程示意图 | |||
|  | |||
| 我们利用 HiSat2将高质量序列比对到人的参考基因组上，然后利用 Qualimap进行对比对质量评估。最后我们利用StringTie进行转录本重构和定量。使用Ballgown进行基因表达水平质量评估。 | |||
| ## 输出文件说明 | |||
| 运行APP后， | |||
| 每个sample对应一个文件夹，内部结构如下： | |||
| - call-fastp | |||
| - <sample_id>.html 简单质控报告 | |||
| - <sample_id>.json | |||
| - <sample_id>_R1.fastq.gz 去接头后R1端接头后的原始数据 | |||
| - <sample_id>_R2.fastq.gz 去接头后R2端接头后的原始数据 | |||
| - call-hisat2 | |||
| - <sample_id>.sam | |||
| - <sample_id>_un.fq.1.gz R1端序列文件没有与人类基因组比对上的序列文件 | |||
| - <sample_id>_un.fq.2.gz R1端序列文件没有与人类基因组比对上的序列文件 | |||
| - call-samtools | |||
| - <sample_id>.sorted.bam 用来存储reads到参考序列二进制格式的比对信息，可以用来进行比对质量分析（使用[qualimap APP](http://choppy.3steps.cn/huangyechao/qualimap)分析） | |||
| - <sample_id>.sorted.bam.bai | |||
| - <sample_id>.ins_size 分析ins_size的文件便于后续分析 | |||
| - call-stringtie | |||
| - <sample_id>.cov.ref.gtf | |||
| - ballgown 下载后可以用R进行转录组下游分析 | |||
| - <sample_id>.gene.abundance.txt 下载后可以用R进行转录组下游分析 | |||
| ## 软件版本及参数 | |||
| ### 软件版本 | |||
| 1. fastp:0.19.6 | |||
| 2. hisat2 :v2.0.5-1 | |||
| 3. samtools:v1.3.1 | |||
| 4. stringtie:v1.3.4 | |||
| ###使用参数 | |||
| 1. fastp.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc | |||
| 2. hisat2.cluster: OnDemand bcs.a2.3xlarge img-ubuntu-vpc | |||
| 3. samtools.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc | |||
| 4. stringtie.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc | |||
| 5. gtf:Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf (oss://pgx-reference-data/reference/annotation/Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf) | |||
| 6. Index:hg38 (oss://pgx-reference-data/reference/hisat2/grch38_snp_tran/) | |||
| ## 参考文献 | |||
| [1]Pertea M , Kim D , Pertea G M , et al. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown[J]. Nature Protocols, 2016, 11(9):1650-1667. | |||
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