> Author : Zhihui Li
>
> E-mail：[18210700119@fudan.edu.cn](mailto:18210700119@fudan.edu.cn)
>
> Git: <http://choppy.3steps.cn/lizhihui/rna-seq.git>
>
> Last Updates: 28/08/2019

## 简介

HISAT+StringTie+Ballgown转录组分析流程主要根据2016年发表在Nature Protocols上的一篇名为Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown的文章撰写的，主要用到以下三个软件：[HISAT] (http://ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml)利用大量FM索引，以覆盖整个基因组，能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对，相较于STAR、Tophat，该软件比对速度快，占用内存少；
[StringTie](http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)能够应用流神经网络算法和可选的de novo组装进行转录本组装并预计表达水平。与Cufflinks等程序相比，StringTie实现了更完整、更准确的基因重建，并更好地预测了表达水平；[Ballgown] (https://github.com/alyssafrazee/ballgown)是R语言中基因差异表达分析的工具，能利用RNA-Seq实验的数据(StringTie, RSEM, Cufflinks)的结果预测基因、转录本的差异表达。`rnaseq`是用于 [Choppy-pipe](http://choppy.3steps.cn/) 系统使用的 APP。本APP能生成表达谱所需的Ballgown文件夹。



## 快速安装及使用

#### Requirements

- Python 3
- [choppy](http://choppy.3steps.cn/)
- Ali-Cloud

在终端中输入以下命令即可快速安装本APP。

```bash
1.安装
$ source activate choppy-py3
$ choppy install lizhihui/rna-seq
$ choppy apps
2.使用
$ choppy samples rna-seq-latest --out Projectname_rnaseq_date_people.csv
$ choppy batch rna-seq-latest Projectname_rnaseq_date_people.csv --project-name Projectname_rnaseq_date_people
```

## 使用方法

### 任务的准备

按照上述步骤安装成功之后，可以通过下面简单的命令即可使用APP：

```bash
# Generate samples file
$ choppy samples rna-seq-latest --out Projectname_rnaseq_date_people.csv
```

`Projectname_fastqc_date_people.csv` 包含以下几个需要填写的参数：

- 文件中必须包含的列为：
  - sample_id：样本名称，该名称将自动作为生成结果文件的前缀名
  - read1：原始FASTQ文件所在的OSS路径（仅R1）
  - read2：原始FASTQ文件所在的OSS路径（仅R2）

```bash
read1,read2,sample_id
# read1  		双端测序数据的R1端在阿里云上的路径信息
# read2  		双端测序数据的R2端在阿里云上的路径信息
# sample_id		每个样本任务的识别码。注意：同一个samples文件中，不同样本的ID应该不同
```

### 任务提交

在配置好`samples.csv` 文件后，使用以下命令可以提交计算任务：

```bash
$ choppy batch rna-seq-latest Projectname_rnaseq_date_people.csv --project-name Projectname_rnaseq_date_people
```

提交成功后，即可在工作目录下找到生成的目录名为Projectname_rnaseq_date_people，里面包含了本次提交任务的所有样本信息。

### 任务输出

任务成功结束后，便可以在阿里云相应的OSS端生成相应的结果文件。包括数据产生的中间结果bam文件以及下游分析所需要的表达谱文件。

## APP流程概述

### 流程示意图

![image-20190828105109404](/Users/lizhihui/Library/Application Support/typora-user-images/image-20190828105109404.png)

​    我们利用 HiSat2将高质量序列比对到人的参考基因组上，然后利用 Qualimap进行对比对质量评估。最后我们利用StringTie进行转录本重构和定量。使用Ballgown进行基因表达水平质量评估。

## 输出文件说明

运行APP后，

每个sample对应一个文件夹，内部结构如下：

- call-hisat2

  - <sample_id>.sam

- call-samtools

  - <sample_id>.sorted.bam  用来存储reads到参考序列二进制格式的比对信息，可以用来进行比对质量分析（使用[qualimap APP](http://choppy.3steps.cn/huangyechao/qualimap)分析） 
  - <sample_id>.sorted.bam.bai

- call-stringtie

  - <sample_id>.cov.ref.gtf
  - ballgown 下载后可以用R进行转录组下游分析

  - <sample_id>.gene.abundance.txt 下载后可以用R进行转录组下游分析



## 软件版本及参数

### 软件版本

1. hisat2 :v2.1.0-2
2. samtools:v1.3.1
3. stringtie:v1.3.4





###使用参数

1. hisat2.cluster: OnDemand bcs.a2.3xlarge img-ubuntu-vpc
2. samtools.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc
3. stringtie.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc
4. gtf:Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf (oss://pgx-reference-data/reference/annotation/Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf)
5. Index:hg38 (oss://pgx-reference-data/reference/hisat2/grch38_snp_tran/)



## 参考文献

[1]Pertea M , Kim D , Pertea G M , et al. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown[J]. Nature Protocols, 2016, 11(9):1650-1667.