### 安装指南 ```bash # 激活choppy环境 source activate choppy # 安装app choppy install chenziyin/miRNAseq ``` ### 快速使用 1. 新建项目文件夹 2. 准备样本描述文件：samples.csv - 文件需为csv格式（以逗号分隔的文本） - 文件中必须包含的列为： - sample_id：样本名称，该名称将自动作为生成结果文件的前缀名 - raw_fastq：原始FASTQ测试数据所在OSS路径（仅R1） - adapter_seq：建库时所使用3’ 接头序列（详见附录A. 常用建库方法接头序列） - randomBase_in_adapter：接头末端的随机碱基个数（详见附录A. 常用建库方法接头序列） - sequencing_length: 测序长度，如使用PE150测序时填写150 > 注意： > > 使用excel制作csv文件时，请不要将保存的csv文件直接作为输入，易导致异常错误。 > > 推荐使用文本编辑器（如记事本，notepad++等）打开csv文件，确认： > > （1）每2个值之间使用逗号分隔，行末没有逗号 > > （2）逗号前后没有多余的空格（非常重要！！！） > > （3）每行前后没有多余的逗号，且没有多余的仅由逗号组成的行 > > 如果在服务器上运行choppy，推荐使用 ``` vim samples.csv``` 命令新建samples.csv文件，并将表格以逗号分隔的纯文本形式粘贴至其中，并按```esc```+```ZZ``` 退出 3. 批量提交任务 ```bash choppy batch miRNAseq-latest --project-name ``` 参数说明： - ``````：此处填写在上一步之做的***samples.csv***所在路径 - ``````：自定义项目名称，app的运行结果将自动存储在以该名称命名的文件夹下 > 注意： > > 1） 左右尖角括号（<>）代表此处的值需要由用户根据实际情况键入相应的值。替换入具体值后左右不需要保留尖叫括号 > > 2）```--project-name```为必须参数，是用户自定义的项目名称。但需注意： > a. project_name中不得包含空格，短横线，否则会导致运行异常 > b. project_name中可以包含阿拉伯数字，但不得以数字开头，否则会导致运行异常 > c. 项目名称不得与已有的项目名称（包含 oss://choppy-cromwell-result/test-choppy/ 目录下的文件夹名称和test-choppy服务器目录下的文件夹名称）相同 > d. 推荐的[项目命名格式]为：Project_computecontent_data_people，如:```ANY180412MAQC_rnaseq_190609_lizhihui``` ### app测试 用于app测试的文件位于 ***oss://choppy-app-example-data/miRNAseq/*** 目录下 - **Test_10k_NEXTflex.fastq.gz** 中包含了NEXTflex small RNA kit v3所建文库的测序结果中的前10000条read - **test_10k_QIAseq.fastq.gz** 中包含了QIAseq miRNA kit所建文库的测序结果中的前10000条read - **samples.csv**是app测试时所需提交的samples.csv文件 ### 输出文件说明 运行APP后， 每个sample对应一个文件夹，内部结构如下： - call-Fastqc - \*._fasqtc.html - \*._fastqc.zip - call-TrimAdapt - .trimAdapt.fastq.gz - .trimAdapt.log - .trimAdapt.lengthDistribute — call-ReadFilter — .trimAdapt.filter.fastq.gz — .filter.log — call-Align2miRNA — .align2miRNA.log — .align2miRNA.sam — .miRNAUnaligned.fastq.gz — call-Align2PreMiRNA — .align2PreMiRNA.log — .align2PreMiRNA.sam — .PreMiRNAUnaligned.fastq.gz - call-Align2piRNA - .align2piRNA.log - .align2piRNA.sam - .piRNAUnaligned.fastq.gz - call-Align2tRNA - .align2tRNA.log - .align2tRNA.sam - .tRNAUnaligned.fastq.gz - call-Align2RNA - .align2RNA.log - .align2RNA.sam - .RNAUnaligned.fastq.gz - call-Align2Hg38 - .align2Hg38.log - .align2Hg38.sam - .Hg38Unaligned.fastq.gz - call-Quantification - .matureMiR.readCount - call-ReadStats - .readStats - .trimAdapt.filter.align2RNA.grouped.readCount #### 主要结果说明 ##### 定量结果 1. miRNA定量表达谱： ```/call-Quantification/.matureMiR.readCount``` - 包含两列： - ID.miRNA - ReadCount：定位到相应miRNA的read数（即Raw Count） ##### 质控结果 1. 测序质量检测：```call-Fastqc/*._fasqtc.html``` - 网页格式，下载后使用浏览器打开 - 重点关注以下内容： - 单碱基测序质量（Per base sequence quality）：横轴长度在75bp前的部分，单碱基质量值应不低于28（绿色部分） - N碱基个数（Per base N count）：红线应紧贴X轴 - 测序片段长度（Sequence Length Distribution）：曲线呈单峰分布（三角形），且峰值与预期测序长度相一致 2. 片段类型统计：```/call-ReadStats/.readStats``` - 可能的片段类型包括： - adapter not found：因无法识别接头而被丢弃的片段数 > 原因：片段3'接头部分存在插入缺失突变（多数），片段中无3'接头序列（少数） - adapter dimer：引物二聚体片段数 - too short：因插入片段长度过短而被丢弃的片段数 - low sequencing quality： 由于质量不满足要求丢弃的read数（包括单碱基质量过低，或N碱基数目过多） - mature miRNA：比对到miRNA成熟体参考序列的片段数 - hairpin miRNA: 比对到miRNA剪切前体参考序列（pre-miRNA）的片段数 - piRNA： 比对到piRNA参考序列的片段数 - tRNA： 比对到tRNA参考序列的片段数 - mRNA： 比对到mRNA参考序列的片段数 - lncRNA： 比对到lncRNA参考序列的片段数 - rRNA： 比对到rRNA参考序列的片段数 - YRNA： 比对到YRNA参考序列的片段数 - other small RNA： 比对到 misc_RNA, guide_RNA, vault_RNA, small nuclear RNA, small cytoplasmic RNA 或 small nucleolar RNA 参考序列的片段数 - other from transcriptome: 比对到人转录组，但比对结果不属于以上mature miRNA等9个类别的片段数 - other from human genome: 能比对到人类参考基因组，但不能比对到转录组上的片段数 - not from human genome：不能比对到人类曹考基因组的片段数 3. 文库中插入片段长度分布： ```call-TrimAdapt/trimAdapt.lengthDistribute``` - 包含两列，记录不同长度（第一列）的插入片段数目（第二列） ### APP概述 miRNAseq analysis pipeline 是一个全自动app，用于对miRNA-seq二代测序FASTQ结果中的human miRNA片段定量。 #### 适用范围： 1. 本APP适用于ILLUMINA系列测序仪（HiSeq, NextSeq, NovaSeq等）产生的SE50/SE75二代测序数据。对于PE数据，仅使用R1作为数据源 2. 本APP仅用于Human miRNA-seq文库数据分析。 3. 目前尚不支持UMI分析 ### 流程与参数 #### 使用的软件及版本 - fastqc: 0.11.5 - fastp：0.19.6 - bowtie: 1.2.2 ### 流程示意 #### 参考基因组 ##### mature miRNA 下载自 *miRBase v22.1* ( [http://www.mirbase.org](http://www.mirbase.org/) ）mature.fa 并进行以下编辑： （1）仅提取出其中人miRNA序列 （2）将U碱基转化为T碱基 （3）根据成熟体所对应的剪切前体（pre-miRNA），将成熟体序列两端各延伸5bp ##### pre-miRNA 下载自 *miRBase v22.1* ( [http://www.mirbase.org](http://www.mirbase.org/) ）hairpin.fa 并进行以下编辑 （1）仅提取出其中人miRNA序列 （2）将U碱基转化为T碱基 ##### piRNA 下载自 piRBase ([http://www.regulatoryrna.org/database/piRNA/download.html]) Human piRNA sequence v2.0 ##### tRNA 下载自 UCSC Table Browser（[http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables] ） - Genome: Human, Assembly: Dec.2013(GRCh38/hg38) - group: all tracks, track: tRNA Genes, table: tRNA - region: genome, - output format: sequence ##### 转录组 全人转录组参考序列下载自 NCBI: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/001/405/GCF_000001405.38_GRCh38.p12/GCF_000001405.38_GRCh38.p12_rna.fna.gz 并根据序列ID中的最后一栏对序列进行分类 ##### 全参考基因组 全人参考基因组序列下载自NCBI：[ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/001/405/GCF_000001405.38_GRCh38.p12/ GCF_000001405.38_GRCh38.p12_genomic.fna.gz] #### 详细参数 1. 切除接头：根据```adapter_sequence``` 序列进行切除，切除时使用fastp默认参数 2. 质量过滤： 1）一条read中，质量不满足```qualified_quality_phred（default:20）``` 的碱基在read占比超过```unqualified_percent_limit(default:20)```%时，该read将被过滤 2） read中，N碱基数目超过```n_base_limit (default: 2)```的read将被过滤 3. 长度过滤：去接头后长度小于```length_required（default：16）```的read将被过滤 4. miRNA识别 - 使用bowtie（end-to-end模式）进行匹配 - 匹配时最多允许```max_mismatch_allowed (default: 1)```个错配 ## 附录 ### A.常用建库方法及接头序列 | 建库试剂盒 | adapter_seq | randomBase_in_adapter | 参考资料 | | ------------------------------------------------------------ | ---------------------- | --------------------- | -------- | | Truseq smallRNA library prep kit (Illumina) | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | 0 | [1] | | QIAseq miRNA Library Kit (QIAGEN) | AACTGTAGGCACCATCAAT | 0 | [2 | | NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB) | AAGATCGGAAGAGCACACGTCT | 0 | [3] | | NEXTflex small RNA Kit | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | 4 | [4] | [1] Illumina Adapter Sequences ([1000000002](http://choppy.3steps.cn/chenziyin/miRNAseq/src/branch/master/commit/1000000002694) v07) From [2] [f12b85b4](http://choppy.3steps.cn/chenziyin/miRNAseq/src/branch/master/commit/f12b85b4)-df4f-43b5-9e82-[a4fd0ddbdc](http://choppy.3steps.cn/chenziyin/miRNAseq/src/branch/master/commit/a4fd0ddbdcc0)&lang=en [3] NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina manual [4] NEXTflex® Small RNA-Seq Kit v3 Automation Guide ### B. FAQ **Q1 结果中没有检测到miRNA / miRNA检出率过低 ** **A1.** 首先需要确认是否切接头成功。方法为打开～/Call-TrimAdapt/trimAdapt.log日志文件，查看Filtering result*项目下的： ***reads with adpater trimmed***：该项为接头切除成功的read数，数值过低说明接头识别失败，需要检查提供的接头序列（```adapter_seq```）是否正确。 之后打开～/call-ReadStats/.readStats文件查看文库中片段组成： （1）***Adapter dimer***较高提示建库过程中连接效率低，文库产物被大量的引物二聚体所占据 （2）***Low quality***较高提示此次测序质量较差，可以用于比对的片段占比较低 （3）***Too short***：较高提示抽提/建库过程存在问题或者样本质量较差，导致文库中插入大量的短（16bp一下）片段 （4）若***For align***： 项数值正常，而检测到的miRNA数量低，考虑 ​ a. 如果建库时使用了4N引物， ​ 查看samples.csv中，```randomBase_in_adapter```是否设置正确。 ​ 查看～/call-TrimAdapt/**.trimAdapt.log**日志文件，若其中没有trim 4 random base相关记录，则可能是```randomBase_in_adapter```设置不正确 ​ 打开～ /call-LengthStats/**.trimAdapt.lengthDistribute**，若片段主要分布在32bp附近，则很可能是4N碱基未切除成功 ​ b. 如果建库时未使用4N引物 ​ 打开～ /call-LengthStats/**.trimAdapt.lengthDistribute**，查看片段长度分布