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readme.md

Author : Zhihui Li

E-mail:18210700119@fudan.edu.cn

Last Updates: 28/02/2020

简介

HISAT+StringTie+Ballgown转录组分析流程主要根据2016年发表在Nature Protocols上的一篇名为Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown的文章撰写的,主要用到以下三个软件:HISAT利用大量FM索引,以覆盖整个基因组,能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对,相较于STAR、Tophat,该软件比对速度快,占用内存少; StringTie能够应用流神经网络算法和可选的de novo组装进行转录本组装并预计表达水平。与Cufflinks等程序相比,StringTie实现了更完整、更准确的基因重建,并更好地预测了表达水平;Ballgown是R语言中基因差异表达分析的工具,能利用RNA-Seq实验的数据(StringTie, RSEM, Cufflinks)的结果预测基因、转录本的差异表达。rnaseq是用于 Choppy-pipe 系统使用的 APP。本APP能生成表达谱所需的Ballgown文件夹。

此版本较rna-seq之前版本更新较多,故新建版本。较之前版本主要更新内容如下:

1.添加了生物信息学软件fastp作为数据预处理的工具,fastp可以快速的去掉接头,且速度较快,同时可以进行简单的质控分析

2.hisat软件会输出unmap的序列文件

3.samtools软件会输出ins_size的信息

快速安装及使用

Requirements

在终端中输入以下命令即可快速安装本APP。

1.安装
$ source activate choppy-py3
$ choppy install lizhihui/rnaseq_fastp
$ choppy apps
2.使用
$ choppy samples rnaseq_fastp-latest --out Projectname_rnaseq_date_people.csv
$ choppy batch rnaseq_fastp-latest Projectname_rnaseq_date_people.csv --project-name Projectname_rnaseq_date_people

使用方法

任务的准备

按照上述步骤安装成功之后,可以通过下面简单的命令即可使用APP:

# Generate samples file
$ choppy samples rna-seq-latest --out Projectname_rnaseq_date_people.csv

Projectname_fastqc_date_people.csv 包含以下几个需要填写的参数:

  • 文件中必须包含的列为:
    • sample_id:样本名称,该名称将自动作为生成结果文件的前缀名
    • read1:原始FASTQ文件所在的OSS路径(仅R1)
    • read2:原始FASTQ文件所在的OSS路径(仅R2)
    • adapter_sequence:R1端需要去除的接头,根据实验室常使用的接头,不填则默认为AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA
    • adapter_sequence_r2:R2端需要去除的接头,根据实验室常使用的接头,不填则默认为AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT
read1,read2,sample_id,adapter_sequence,adapter_sequence_r2
# read1  		双端测序数据的R1端在阿里云上的路径信息
# read2  		双端测序数据的R2端在阿里云上的路径信息
# sample_id		每个样本任务的识别码。注意:同一个samples文件中,不同样本的ID应该不同
# adapter_sequence		R1端需要去除的接头,以"AGATC"的形式填写,可以不填,不填则为默认参数
# adapter_sequence_r2	R2端需要去除的接头,以"AGATC"的形式填写,可以不填,不填则为默认参数

任务提交

在配置好samples.csv 文件后,使用以下命令可以提交计算任务:

$ choppy batch rnaseq_fastp-latest Projectname_rnaseq_date_people.csv --project-name Projectname_rnaseq_date_people

提交成功后,即可在工作目录下找到生成的目录名为Projectname_rnaseq_date_people,里面包含了本次提交任务的所有样本信息。

任务输出

任务成功结束后,便可以在阿里云相应的OSS端生成相应的结果文件。包括数据产生的中间结果bam文件以及下游分析所需要的表达谱文件。

APP流程概述

流程示意图

image-20190828105109404

​ 我们利用 HiSat2将高质量序列比对到人的参考基因组上,然后利用 Qualimap进行对比对质量评估。最后我们利用StringTie进行转录本重构和定量。使用Ballgown进行基因表达水平质量评估。

输出文件说明

运行APP后,

每个sample对应一个文件夹,内部结构如下:

  • call-fastp

    • .html 简单质控报告
    • .json
    • _R1.fastq.gz 去接头后R1端接头后的原始数据
    • _R2.fastq.gz 去接头后R2端接头后的原始数据
  • call-hisat2

    • .sam
    • _un.fq.1.gz R1端序列文件没有与人类基因组比对上的序列文件
    • _un.fq.2.gz R1端序列文件没有与人类基因组比对上的序列文件
  • call-samtools

    • .sorted.bam 用来存储reads到参考序列二进制格式的比对信息,可以用来进行比对质量分析(使用qualimap APP分析)
    • .sorted.bam.bai
    • .ins_size 分析ins_size的文件便于后续分析
  • call-stringtie

    • .cov.ref.gtf
    • ballgown 下载后可以用R进行转录组下游分析

    • .gene.abundance.txt 下载后可以用R进行转录组下游分析

软件版本及参数

软件版本

  1. fastp:0.19.6
  2. hisat2 :v2.1
  3. samtools:v1.3.1
  4. stringtie:v1.3.4

使用参数

  1. fastp.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc
  2. hisat2.cluster: OnDemand bcs.a2.3xlarge img-ubuntu-vpc
  3. samtools.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc
  4. stringtie.cluster: OnDemand bcs.a2.large img-ubuntu-vpc
  5. gtf:Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf (oss://pgx-reference-data/reference/annotation/Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf)
  6. Index:hg38 (oss://pgx-reference-data/reference/hisat2/grch38_snp_tran/)

参考文献

[1]Pertea M , Kim D , Pertea G M , et al. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown[J]. Nature Protocols, 2016, 11(9):1650-1667.

[2]Shifu Chen, Yanqing Zhou, Yaru Chen, Jia Gu; fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor, Bioinformatics, Volume 34, Issue 17, 1 September 2018, Pages i884–i890, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty560